非洲豬瘟檢測瓶頸之核酸提取與純化
發布時間：2019-10-21 閱讀：328次
眼下，豬價高漲，政策加持，加上一年多的抗非歷練，讓很多養豬人從怦然心動，到悄然行動，開啟了復養之路。此刻，且不論非洲豬瘟威脅下的復養勝算幾何，如履薄冰的忐忑是一望而知的。面對非洲豬瘟，都說“防非千萬條，生物安全條”，除此之外，在抗擊非洲豬瘟的過程中，有的豬場消失了，而有的豬企趁勢崛起，個中經驗教訓也值得反思。痛定思痛，目前有效的防控非洲豬瘟策略是什么？撥云見日之后，有哪些實用技術是切實可行的？
非洲豬瘟“化”以來，關于該病毒實驗室檢測內容的討論越來越多，取得的科技進展也越來越大。從樣本的采集、運輸、保存到核酸的提取、擴增，任何一個環節出現問題，都會大大降低非洲豬瘟病毒檢測工作的敏感性。在2018年8月份和2019年3月份之間，這種檢測敏感性較低的情況尤為突出。
唾液學檢測具有較高的生產現實意義，該方法已經成為非洲豬瘟檢測工作的方法。血液學檢測過渡至唾液學檢測的過程中，同樣也出現了很多的問題，這些問題正在被逐步解決。
先是唾液中病毒核酸被干擾的問題嚴重影響了唾液學檢測技術的推廣進度。唾液中的活性酶會大大縮短樣本中目標核酸的半衰期，導致漏檢率的居高不下，嚴重影響了定點清除（拔牙式清除）工作的效率。不過，隨著各個試劑公司推出唾液樣本保護液，該問題已經得到較好的解決。
根據近期實驗室研究比對得到的情況，病毒核酸的提取和純化再次成為約束唾液學檢測的另外一個重要瓶頸，這個問題如果不能及時得到解決將大大阻礙明年春季非洲豬瘟疫情的防控工作。
非洲豬瘟病毒大多數存在于細胞之內，病毒核酸也被雙層囊膜和多層蛋白質緊緊包裹，只有將病毒核酸徹底釋放并純化，才能實現核酸的有效擴增。在實際的實驗室檢測工作中，尤其是唾液學檢測工作中，經常性出現漏檢（假陰性）的情況，這些情況大大困擾了生產技術人員和實驗室檢測人員，嚴重制約了非洲豬瘟的定點清除工作和未來非洲豬瘟凈化工作的效果。
根據現代生物技術研究的進展，病毒核酸的提取和純化總體上分成三步：核酸釋放、核酸純化和收集。
各個試劑公司出品的試劑盒具有相對的不完備性，往往通過增加繁瑣的步驟試圖完成核酸的提取和純化工作，但增加提取步驟會大大降低了核酸的得率。所以，簡化操作過程將成為核酸提取和純化研究的要任務。
核酸釋放：組織細胞內和病原體內的核酸釋放可以通過反復凍融法、機械研磨法和化學裂解法進行。無論采用哪一種方法，內源性和外源性核酸酶都會降低核酸的得率。實際操作中往往通過采用較低的溫度條件、快速的機械研磨或加核酸酶抑制劑等方法避免核酸酶的降解作用。
核酸純化：裂解后的液體中除了含有核酸成分以外，還有大量的雜質，如蛋白、多糖以及其它化學物質。這些雜質不除去，可能會嚴重影響后續的核酸擴增。核酸純化的常見方法有酚-氯仿法、膜吸附法和磁珠吸附法。由于使用了有毒有害的化學物質，酚-氯仿法基本上已經被棄用，而采用吸附法純化核酸將成為未來的主流。
收集：核酸的收集比較簡單，吸附在膜上或磁珠上的核酸可以用純水洗脫。但是，為了提高核酸得率并保護核酸，可以用特殊的溶液進行洗脫。
EDTA會抑制后續的分子生物學反應，不建議使用TE進行核酸洗脫。
核酸提取與純化（柱提法）的商品化套裝應該包括：裂解液1瓶（建議使用棕色瓶，裂解液中要求包含助吸附成分（Binding buffer），減少操作步驟），清洗液1瓶（建議使用白色瓶，使用前加入適量無水乙醇或異丙醇），洗脫液1瓶，吸附柱（若干），簡易說明書（1份）。
核酸提取與純化的標準操作程序建議如下：
1、裂解：取離心管，管內加入待檢液體樣本100～200ul以及裂解液（Lysis buffer）600ul，輕搖、混勻；
2、吸附：吸附柱內加入無水乙醇300ul和上述裂解液體300ul（上述離心管內剩余的裂解樣本可留作備份），1x10^4 rpm，30秒，棄液；
3、洗滌：吸附柱內加入600ul清洗液（Wash buffer），1x104rpm，30秒，棄液（重復此步驟1次）。棄液后，1x10^4 rpm，再次離心3分鐘；
4、收集：換套管，吸附柱內加入約50ul洗脫液（Rinse buffer），輕搖、混勻，1x10^4 rpm，30秒，保留濾液，冷凍保存，備用。
若采用該標準程序，基本上可以在10分鐘之內完成核酸提取和純化的操作步驟，大大縮短后續分子生物學操作的時間。
核酸提取與純化的未來發展方向是：操作簡單化、試劑環保化、核酸優質化。
操作簡單化：盡量不使用酶類（如蛋白酶K等）成分，提高試劑存放的便捷性；減少操作步驟或實現機器自動操作。對于少量樣本來說，人工提取的效率（得率）要高于機器提取的效率。
試劑環保化：避免提取和純化試劑中包含有毒有害的物質，尤其是禁止使用揮發性有毒物質（如酚、氯仿、巰基乙醇、二硫蘇糖醇等），這些物質可能會對實驗室操作人造成身體的傷害。
核酸優質化：如果提取的核酸用于PCR等反應，建議提取總核酸（DNA和RNA），減少分步提取的繁瑣程序，通過特殊的方法保持核酸一級結構的完整性并減少核酸之間的物理纏繞。對于豬群的檢測來說，一次性提取的核酸可以用來檢測豬瘟、藍耳、非洲豬瘟、偽狂犬和環狀病毒以及細菌感染等，大大減輕檢測工作的負擔。
非洲豬瘟“化”以來，關于該病毒實驗室檢測內容的討論越來越多，取得的科技進展也越來越大。從樣本的采集、運輸、保存到核酸的提取、擴增，任何一個環節出現問題，都會大大降低非洲豬瘟病毒檢測工作的敏感性。在2018年8月份和2019年3月份之間，這種檢測敏感性較低的情況尤為突出。
唾液學檢測具有較高的生產現實意義，該方法已經成為非洲豬瘟檢測工作的方法。血液學檢測過渡至唾液學檢測的過程中，同樣也出現了很多的問題，這些問題正在被逐步解決。
先是唾液中病毒核酸被干擾的問題嚴重影響了唾液學檢測技術的推廣進度。唾液中的活性酶會大大縮短樣本中目標核酸的半衰期，導致漏檢率的居高不下，嚴重影響了定點清除（拔牙式清除）工作的效率。不過，隨著各個試劑公司推出唾液樣本保護液，該問題已經得到較好的解決。
根據近期實驗室研究比對得到的情況，病毒核酸的提取和純化再次成為約束唾液學檢測的另外一個重要瓶頸，這個問題如果不能及時得到解決將大大阻礙明年春季非洲豬瘟疫情的防控工作。
非洲豬瘟病毒大多數存在于細胞之內，病毒核酸也被雙層囊膜和多層蛋白質緊緊包裹，只有將病毒核酸徹底釋放并純化，才能實現核酸的有效擴增。在實際的實驗室檢測工作中，尤其是唾液學檢測工作中，經常性出現漏檢（假陰性）的情況，這些情況大大困擾了生產技術人員和實驗室檢測人員，嚴重制約了非洲豬瘟的定點清除工作和未來非洲豬瘟凈化工作的效果。
根據現代生物技術研究的進展，病毒核酸的提取和純化總體上分成三步：核酸釋放、核酸純化和收集。
各個試劑公司出品的試劑盒具有相對的不完備性，往往通過增加繁瑣的步驟試圖完成核酸的提取和純化工作，但增加提取步驟會大大降低了核酸的得率。所以，簡化操作過程將成為核酸提取和純化研究的要任務。
核酸釋放：組織細胞內和病原體內的核酸釋放可以通過反復凍融法、機械研磨法和化學裂解法進行。無論采用哪一種方法，內源性和外源性核酸酶都會降低核酸的得率。實際操作中往往通過采用較低的溫度條件、快速的機械研磨或加核酸酶抑制劑等方法避免核酸酶的降解作用。
核酸純化：裂解后的液體中除了含有核酸成分以外，還有大量的雜質，如蛋白、多糖以及其它化學物質。這些雜質不除去，可能會嚴重影響后續的核酸擴增。核酸純化的常見方法有酚-氯仿法、膜吸附法和磁珠吸附法。由于使用了有毒有害的化學物質，酚-氯仿法基本上已經被棄用，而采用吸附法純化核酸將成為未來的主流。
收集：核酸的收集比較簡單，吸附在膜上或磁珠上的核酸可以用純水洗脫。但是，為了提高核酸得率并保護核酸，可以用特殊的溶液進行洗脫。
EDTA會抑制后續的分子生物學反應，不建議使用TE進行核酸洗脫。
核酸提取與純化（柱提法）的商品化套裝應該包括：裂解液1瓶（建議使用棕色瓶，裂解液中要求包含助吸附成分（Binding buffer），減少操作步驟），清洗液1瓶（建議使用白色瓶，使用前加入適量無水乙醇或異丙醇），洗脫液1瓶，吸附柱（若干），簡易說明書（1份）。
核酸提取與純化的標準操作程序建議如下：
1、裂解：取離心管，管內加入待檢液體樣本100～200ul以及裂解液（Lysis buffer）600ul，輕搖、混勻；
2、吸附：吸附柱內加入無水乙醇300ul和上述裂解液體300ul（上述離心管內剩余的裂解樣本可留作備份），1x10^4 rpm，30秒，棄液；
3、洗滌：吸附柱內加入600ul清洗液（Wash buffer），1x104rpm，30秒，棄液（重復此步驟1次）。棄液后，1x10^4 rpm，再次離心3分鐘；
4、收集：換套管，吸附柱內加入約50ul洗脫液（Rinse buffer），輕搖、混勻，1x10^4 rpm，30秒，保留濾液，冷凍保存，備用。
若采用該標準程序，基本上可以在10分鐘之內完成核酸提取和純化的操作步驟，大大縮短后續分子生物學操作的時間。
核酸提取與純化的未來發展方向是：操作簡單化、試劑環保化、核酸優質化。
操作簡單化：盡量不使用酶類（如蛋白酶K等）成分，提高試劑存放的便捷性；減少操作步驟或實現機器自動操作。對于少量樣本來說，人工提取的效率（得率）要高于機器提取的效率。
試劑環保化：避免提取和純化試劑中包含有毒有害的物質，尤其是禁止使用揮發性有毒物質（如酚、氯仿、巰基乙醇、二硫蘇糖醇等），這些物質可能會對實驗室操作人造成身體的傷害。
核酸優質化：如果提取的核酸用于PCR等反應，建議提取總核酸（DNA和RNA），減少分步提取的繁瑣程序，通過特殊的方法保持核酸一級結構的完整性并減少核酸之間的物理纏繞。對于豬群的檢測來說，一次性提取的核酸可以用來檢測豬瘟、藍耳、非洲豬瘟、偽狂犬和環狀病毒以及細菌感染等，大大減輕檢測工作的負擔。
綜上所述，豬群病原的核酸檢測工作研究任重道遠，值得進一步深入探索。
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